辣椒生物碱目前已知的成分约 19种，其中辣椒素和二氢辣椒素占辣椒碱类化合物总量的 90%以上[1–3]。研究表明，辣椒素可阻止有毒物质侵害人体细胞DNA，降低细胞癌变发生[4]，保护心血管[5]，抗氧化[6]，抑菌，加快脂肪代谢与分解，促进能量消耗[7]，对三叉神经痛[8]、糖尿病性神经痛有显著疗效；可防治动物的腹泻、炎症等疾病[9]； 同时，辣椒素作为新型绿色农药，可用于水果、蔬菜及谷物害虫的防治[10]。近年来，国内外对辣椒生物碱的提取、富集及纯化等方面的研究较多[11–13]，辣椒生物碱各单体组分结构及理化性质非常相似，如辣椒素和二氢辣椒素只是碳链第6位单双键的差别[9]，因此分离难度较大。目前，对辣椒生物碱单体的制备主要采用制备液相、薄层色谱、硅胶柱层析、纸色谱等，这些方法存在工序复杂繁琐，重现性差，制备量小等缺点。文献[14]中运用高速逆流色谱方法分离辣椒素，但样品前处理需经过提取、大孔吸附树脂纯化等过程，操作复杂，损耗多，成本高。本研究中，以干辣椒为材料，采用简单的样品前处理方法，筛选并优化高速逆流分离体系，同时采用连续进样方式，实现辣椒生物碱中2种主要生物碱的快速制备，并对2个化合物的抗炎活性进行初步研究，现将结果报道如下。 1 材料与方法 1.1 材料 供试红干辣椒购于湖南省吉首市；巨噬细胞RAW264.7购买于暨南大学。 主要试剂：乙酸、正己烷、甲醇、乙酸乙酯均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司产品)；乙腈色谱醇(天地公司产品)；DMEM培养基、新生牛血清(Gibco产品)；青–链霉素(Hyclone产品)、胎牛血清(杭州四季青公司产品)；MTT、DMSO(Sigma产品)；Griess试剂(上海碧云天生物技术有限公司产品)。 主要仪器与设备：MODULYOD–230冷冻干燥机(Thermo Fisher Scientific，美国)；HPLC–20A 高效液相色谱(Shimadzu，日本)，色谱柱GL Science WondasilTM C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；高速逆流色谱(TBE–300A聚四氟乙烯柱，内径1.6 mm，柱容积280 mL，转速0~1 000 r/min，上海同田公司)；CO2细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific，美国)；CKX41倒置显微镜(Olympus，日本)；MK3型酶标仪(Bio–Rad， 芬兰)；Agilent 1260 UPLC–G 6530 QTOF质谱联用仪(Agilent，美国)；Bruke 400M核磁共振仪(Bruke，瑞士)。 1.2 方法 1.2.1 辣椒生物碱提取溶剂的确定 取辣椒粉，分别用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正已烷等不同极性溶剂对红辣椒原料进行提取。提取液进行HPLC分析。流动相A为0.2%磷酸，流动相B为乙腈。梯度洗脱：0~5 min，50%→50% B；5~20 min，50%→70% B；流速1 mL / min，柱温 35℃，检测波长280 nm。根据色谱峰的UV光谱特征确定目标化合物，以HPLC图谱选择最佳提取溶剂。 1.2.2 辣椒生物碱的高速逆流色谱(HSCCC)分离 1) 粗提物的制备。取0.5 kg辣椒粉，采用1.2.1中确定的溶剂为提取剂，60 ℃下回流浸提1 h，过滤，滤渣再次在同等条件下浸提2次，合并滤液，40 ℃减压浓缩至膏状，得粗提物。 2) 最佳溶剂体系的选择。设正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水、冰乙酸体积比分别为15∶15∶20∶20∶4、15∶15∶20∶20∶3.5、10∶15∶20∶20∶4、15∶15∶20∶20∶6、15∶15∶20∶20∶7.5，振摇后静置分层。移取3 mL下相加入少量上述膏状粗提物，用等体积上相进行萃取，分别测定萃前和萃后下相中目标峰面积，按下式计算出各组分的分配系数。选择 K值适合的溶剂体系作为 HSCCC的溶剂体系。K值的计算：K= 。式中K为各组分分配系数；S1为萃取前的目标峰面积；S2为萃取后的目标峰面积。 3) HSCCC分离效果的考察。选取上述确定的最佳溶剂体系，静置过夜，两相分离后超声脱气 30 min。上相作固定相，下相作流动相。将固定相以20 mL/min的流速泵满管路，850 r/min正转，流速 2 mL/min的条件泵入流动相，温度25 ℃，检测波长280 nm，计算保留率P。取40 mL下相溶解膏状粗提物600 mg，第1次进样20 mL后进行数据采集，150~160 min，进行第2次进样(20 mL)。根据色谱图分步收集110~130、138~159、251~271、280~299 min时的流出物，合并相同化合物流出液，55 ℃减压浓缩，冷冻、干燥，得干粉。取干粉，加少量甲醇溶解，HPLC进样，采用峰面积归一法计算组分纯度。P = ′100%。式中：P为保留率；V为总体积； 1 V2为推出固定相体积；V3为管路体积。 4) 化合物结构的鉴定。制备所得的2个化合物通过质谱和核磁光谱确定结构。 1.2.3 化合物抗炎活性的测定 1) 细胞培养。通过脂多糖(LPS)诱导构建炎症模型。设以下处理：正常对照组(细胞)；PS模型组(细胞+LPS)；试验组1(细胞+LPS+化合物1)；试验组2(细胞+LPS+化合物2)；阳性对照组(细胞+LPS+吲哚美辛)。巨噬细胞RAW264.7采用DMEM培养基(含10%小牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL)培养，置于37 ℃、5%的CO2培养箱中，根据细胞的生长状态，每1~3 d换1次培养液。 2) 细胞活力的检测。采用MTT检测细胞活力。取对数生长期的巨噬细胞 RAW264.7以 4×104个/孔板铺于96孔板，100 μL/孔，培养箱中培养24 h，模型组和试验组均加100 ng/mL LPS，1 h后，试验组1、试验组2分别加化合物1、化合物2。2种化合物设置 6个浓度，分别为 3.1、6.3、12.5、25、50、100 μmol/L，吲哚美辛试验组浓度为 10 μmol/L。每个浓度3个复孔，培养48 h。移除培养基，加入30 μL MTT，继续培养 4 h，弃去上清液，加 200 μL DMSO溶解反应产物，避光轻微振荡10 min，待结晶完全溶解后，用酶标仪在波长570 nm处测定各孔吸光度值，计算细胞存活率。 3) NO释放量的测定。采用Griess法测定NO释放量。培养及铺板方法同细胞活力检测中的方法。模型组和试验组均加100 ng/mL LPS，1 h后，试验组1、2分别加化合物1、化合物2。2种药物设置 6个浓度，分别为 3.1、6.3、12.5、25、50、100 μmol/L，吲哚美辛浓度为 10 μmol/L，每个浓度3个复孔，培养48 h。用DMEM稀释 NO 检测试剂盒中的标准品NaNO2，分别配制成 50 μL 0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L的标准品溶液。孔板在培养箱中继续培养24 h，室温放置10 min，采用Griess法，各孔均加等体积的Griess试剂，用酶标仪540 nm处测定各孔吸光度值，参照标准品的标准曲线及回归方程求出待测样本NO浓度。 2 结果与分析 2.1 不同提取溶剂对辣椒生物碱提取效果的HPLC分析结果 在1.2.1条件下对提取液进行HPLC分析，结果显示正己烷提取效果最佳，杂峰少，HPLC图谱(图1)显示主要有2个色谱峰，在227、280 nm有较大吸收，符合辣椒生物碱的UV光谱特征，确定为辣椒生物碱，故选择以正己烷为提取溶剂。 图1 正己烷提取物的HPLC图及UV光谱图Fig.1 HPLC chromatogram and UV spectrum of extract obtained by n–hexane 2.2 辣椒生物碱的高速逆流色谱(HSCCC)分离结果 2.2.1 HSCCC两相溶剂体系的确定 多个不同配比的溶剂体系的K值测定结果(表1)表明，体系5即正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水、冰乙酸体积比为15∶15∶20∶20∶7.5时，化合物1、化合物2的K值较小，分离度值最大，可作为后续分离体系。 表 1 不同溶剂体系的K值及分离度Table 1 K–values and resolutions of the compounds in different two–phase solvent systemsK值体系 正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水∶冰乙酸(V/V) 组分I 组分II 分离度1 15∶15∶20∶20∶4 3.68 5.34 1.45 2 15∶15∶20∶20∶3.5 3.70 5.70 1.54 3 10∶15∶20∶20∶4 3.69 5.94 1.61 4 15∶15∶20∶20∶6 2.10 2.90 1.38 5 15∶15∶20∶20∶7.5 1.80 2.99 1.66 图2 HSCCC分离色谱图Fig.2 HSCCC chromatogram of the purification of capsaicinoids from capsicum 图3 化合物1的 HPLC 检测图谱及UV图Fig.3 HPLC chromatogram and UV spectrum of compound 1 2.3 HSCCC分离条件优化及分离效果 2次进样收集的流出液Ⅰ、Ⅱ，HSCCC分离色谱图见图2。经HPLC检测分别为化合物1、化合物2，见图3、图4。得到纯度为98.2%的化合物1干粉22 mg，纯度为98.0%的化合物2干粉16 mg。 图4 化合物2的HPLC图和UV光谱图Fig.4 HPLC chromatogram and UV spectrum of compound 2 2.4 化合物结构的鉴定结果 得到的化合物1、化合物2均为白色粉末， 正离子模式ESI–MS，m/z分别为308.226 7[M+H]+、306.216 2[M+H]+，其核磁共振H谱与C谱信息如表2所示。结合文献[15]，确定化合物1、化合物2分别为二氢辣椒素和辣椒素，其结构式如图5所示。 表2 二氢辣椒素和辣椒素核磁共振H谱与C谱信息Table 2 1H and 13C NMR spectroscopic datas for capsaicin and dihydrocapsaicin.化合物1 化合物2 13C NMR DEPT 1H NMR 13C NMR DEPT 1H NMR 1 130.577 C — 131.545 C 4.33 (d, 5.4)2 110.840 CH 6.76(s) 112.489 CH 6.79(d,1.8)3 146.842 C — 148.992 C —4 145.281 C — 146.814 C —5 114.507 CH 6.84(d,8.4) 116.088 CH 6.84(d,8.4)6 120.967 CH 6.74(d,8.4) 121.411 CH 6.74(dd,1.8,8.4)7 43.685 CH2 4.33(d,5.4) 43.956 CH2 4.33 (d, 5.4)8 — — 5.93(br s) — — 5.90 (br s)9 173.020 C — 175.945 C —10 37.037 CH2 2.19(t,7.8) 36.979 CH2 2.20 (t, 7.8)11 25.944 CH2 1.64(q,7.2) 26.585 CH2 1.64 (q, 7.8)12 29.509 CH2 1.31(m) 30.291 CH2 1.38 (q, 7.8)13 29.767 CH2 1.29(m) 32.269 CH2 1.98 (q, 7.2)14 27.382 CH2 1.26(m) 127.863 CH 5.35 (m)15 39.099 CH2 1.13(m) 139.100 CH 5.30 (m)16 28.088 CH 1.50(m) 33.250 CH 1.29 (s)17 22.767 CH3 0.84(d,6.0) 23.108 CH3 0.95 (d, 6.6)18 22.767 CH3 0.85(d,6.0) 23.108 CH3 0.94 (d, 6.6)OCH3 56.091 CH3 3.85(s) 56.355 CH3 3.85 (s)OH — — 5.89(br s) — — 5.86 (br s) 图5 化合物1、化合物2的化学结构式Fig. 5 Structures of compound 1 and 2 2.5 2个化合物的抗炎活性 1) 化合物对细胞活力的影响。经二氢辣椒素、辣椒素处理后的巨噬细胞 RAW264.7活力与空白组、模型组无明显差异，且随着二氢辣椒素、辣椒素浓度的增高，巨噬细胞RAW264.7的活力基本不变。由表3可知，在 3.1 ~ 100 μmol/L范围内，二氢辣椒素和辣椒素对巨噬细胞RAW264.7活力没有影响，对巨噬细胞RAW264.7没有毒性。 表3 不同浓度的二氢辣椒素和辣椒素对RAW264.7细胞活力的影响Table 3 Effect of different concentrations of capsaicin and dihydrocapsaicin on RAW264.7 cell viabilityRAW264.7存活率%各浓度组别 化合物1 化合物2 100.0 μmol/L 99.8 99.4 50.0 μmol/L 96.2 97.6 25.0 μmol/L 102.7 99.4 12.5 μmol/L 100.8 100.5 6.3 μmol/L 97.7 101.9 3.1 μmol/L 100.7 101.9空白组 100.0 100.0模型组 100.6 103.6 2) 化合物对炎症细胞NO释放量的影响。二氢辣椒素、辣椒素和阳性对照吲哚美辛对巨噬细胞RAW264.7释放 NO 的 IC50分别为(42.66±4.88)、(25.68±3.86)、(127.88 ± 2.45) μmol/L；因此，辣椒素和二氢辣椒素的抗炎作用均明显强于吲哚美辛，且辣椒素的抗炎效果好于二氢辣椒素。 3 结论 通过正己烷回流提取干辣椒粉的生物碱，采用正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水、冰乙酸的体积比15∶15∶20∶20∶7.5为溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，流速2 mL/min，主机转速850 r/min，分离温度25 ℃，检测波长为270 nm，600 mg样品采用高速逆流色谱分2次连续进样，获得22 mg、纯度为98.2%二氢辣椒素和16 mg、纯度为98.0%的辣椒素。二氢辣椒素、辣椒素对巨噬细胞RAW264.7释放 NO 的 IC50分别为(42.66±4.88)、(25.68±3.86) μmol/L，明显低于阳性对照吲哚美辛；因此，辣椒素和二氢辣椒素对巨噬细胞 RAW264.7的抗炎作用均明显强于吲哚美辛，且辣椒素的抗炎效果好于二氢辣椒素。 辣椒生物碱目前已知的成分约 19种，其中辣椒素和二氢辣椒素占辣椒碱类化合物总量的 90%以上[1–3]。研究表明，辣椒素可阻止有毒物质侵害人体细胞DNA，降低细胞癌变发生[4]，保护心血管[5]，抗氧化[6]，抑菌，加快脂肪代谢与分解，促进能量消耗[7]，对三叉神经痛[8]、糖尿病性神经痛有显著疗效；可防治动物的腹泻、炎症等疾病[9]； 同时，辣椒素作为新型绿色农药，可用于水果、蔬菜及谷物害虫的防治[10]。近年来，国内外对辣椒生物碱的提取、富集及纯化等方面的研究较多[11–13]，辣椒生物碱各单体组分结构及理化性质非常相似，如辣椒素和二氢辣椒素只是碳链第6位单双键的差别[9]，因此分离难度较大。目前，对辣椒生物碱单体的制备主要采用制备液相、薄层色谱、硅胶柱层析、纸色谱等，这些方法存在工序复杂繁琐，重现性差，制备量小等缺点。文献[14]中运用高速逆流色谱方法分离辣椒素，但样品前处理需经过提取、大孔吸附树脂纯化等过程，操作复杂，损耗多，成本高。本研究中，以干辣椒为材料，采用简单的样品前处理方法，筛选并优化高速逆流分离体系，同时采用连续进样方式，实现辣椒生物碱中2种主要生物碱的快速制备，并对2个化合物的抗炎活性进行初步研究，现将结果报道如下。1 材料与方法1.1 材料供试红干辣椒购于湖南省吉首市；巨噬细胞RAW264.7购买于暨南大学。主要试剂：乙酸、正己烷、甲醇、乙酸乙酯均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司产品)；乙腈色谱醇(天地公司产品)；DMEM培养基、新生牛血清(Gibco产品)；青–链霉素(Hyclone产品)、胎牛血清(杭州四季青公司产品)；MTT、DMSO(Sigma产品)；Griess试剂(上海碧云天生物技术有限公司产品)。主要仪器与设备：MODULYOD–230冷冻干燥机(Thermo Fisher Scientific，美国)；HPLC–20A 高效液相色谱(Shimadzu，日本)，色谱柱GL Science WondasilTM C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；高速逆流色谱(TBE–300A聚四氟乙烯柱，内径1.6 mm，柱容积280 mL，转速0~1 000 r/min，上海同田公司)；CO2细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific，美国)；CKX41倒置显微镜(Olympus，日本)；MK3型酶标仪(Bio–Rad， 芬兰)；Agilent 1260 UPLC–G 6530 QTOF质谱联用仪(Agilent，美国)；Bruke 400M核磁共振仪(Bruke，瑞士)。1.2 方法1.2.1 辣椒生物碱提取溶剂的确定取辣椒粉，分别用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正已烷等不同极性溶剂对红辣椒原料进行提取。提取液进行HPLC分析。流动相A为0.2%磷酸，流动相B为乙腈。梯度洗脱：0~5 min，50%→50% B；5~20 min，50%→70% B；流速1 mL / min，柱温 35℃，检测波长280 nm。根据色谱峰的UV光谱特征确定目标化合物，以HPLC图谱选择最佳提取溶剂。1.2.2 辣椒生物碱的高速逆流色谱(HSCCC)分离1) 粗提物的制备。取0.5 kg辣椒粉，采用1.2.1中确定的溶剂为提取剂，60 ℃下回流浸提1 h，过滤，滤渣再次在同等条件下浸提2次，合并滤液，40 ℃减压浓缩至膏状，得粗提物。2) 最佳溶剂体系的选择。设正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水、冰乙酸体积比分别为15∶15∶20∶20∶4、15∶15∶20∶20∶3.5、10∶15∶20∶20∶4、15∶15∶20∶20∶6、15∶15∶20∶20∶7.5，振摇后静置分层。移取3 mL下相加入少量上述膏状粗提物，用等体积上相进行萃取，分别测定萃前和萃后下相中目标峰面积，按下式计算出各组分的分配系数。选择 K值适合的溶剂体系作为 HSCCC的溶剂体系。K值的计算：K=。式中K为各组分分配系数；S1为萃取前的目标峰面积；S2为萃取后的目标峰面积。3) HSCCC分离效果的考察。选取上述确定的最佳溶剂体系，静置过夜，两相分离后超声脱气 30 min。上相作固定相，下相作流动相。将固定相以20 mL/min的流速泵满管路，850 r/min正转，流速 2 mL/min的条件泵入流动相，温度25 ℃，检测波长280 nm，计算保留率P。取40 mL下相溶解膏状粗提物600 mg，第1次进样20 mL后进行数据采集，150~160 min，进行第2次进样(20 mL)。根据色谱图分步收集110~130、138~159、251~271、280~299 min时的流出物，合并相同化合物流出液，55 ℃减压浓缩，冷冻、干燥，得干粉。取干粉，加少量甲醇溶解，HPLC进样，采用峰面积归一法计算组分纯度。P =′100%。式中：P为保留率；V为总体积；1V2为推出固定相体积；V3为管路体积。4) 化合物结构的鉴定。制备所得的2个化合物通过质谱和核磁光谱确定结构。1.2.3 化合物抗炎活性的测定1) 细胞培养。通过脂多糖(LPS)诱导构建炎症模型。设以下处理：正常对照组(细胞)；PS模型组(细胞+LPS)；试验组1(细胞+LPS+化合物1)；试验组2(细胞+LPS+化合物2)；阳性对照组(细胞+LPS+吲哚美辛)。巨噬细胞RAW264.7采用DMEM培养基(含10%小牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL)培养，置于37 ℃、5%的CO2培养箱中，根据细胞的生长状态，每1~3 d换1次培养液。2) 细胞活力的检测。采用MTT检测细胞活力。取对数生长期的巨噬细胞 RAW264.7以 4×104个/孔板铺于96孔板，100 μL/孔，培养箱中培养24 h，模型组和试验组均加100 ng/mL LPS，1 h后，试验组1、试验组2分别加化合物1、化合物2。2种化合物设置 6个浓度，分别为 3.1、6.3、12.5、25、50、100 μmol/L，吲哚美辛试验组浓度为 10 μmol/L。每个浓度3个复孔，培养48 h。移除培养基，加入30 μL MTT，继续培养 4 h，弃去上清液，加 200 μL DMSO溶解反应产物，避光轻微振荡10 min，待结晶完全溶解后，用酶标仪在波长570 nm处测定各孔吸光度值，计算细胞存活率。3) NO释放量的测定。采用Griess法测定NO释放量。培养及铺板方法同细胞活力检测中的方法。模型组和试验组均加100 ng/mL LPS，1 h后，试验组1、2分别加化合物1、化合物2。2种药物设置 6个浓度，分别为 3.1、6.3、12.5、25、50、100 μmol/L，吲哚美辛浓度为 10 μmol/L，每个浓度3个复孔，培养48 h。用DMEM稀释 NO 检测试剂盒中的标准品NaNO2，分别配制成 50 μL 0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L的标准品溶液。孔板在培养箱中继续培养24 h，室温放置10 min，采用Griess法，各孔均加等体积的Griess试剂，用酶标仪540 nm处测定各孔吸光度值，参照标准品的标准曲线及回归方程求出待测样本NO浓度。2 结果与分析2.1 不同提取溶剂对辣椒生物碱提取效果的HPLC分析结果在1.2.1条件下对提取液进行HPLC分析，结果显示正己烷提取效果最佳，杂峰少，HPLC图谱(图1)显示主要有2个色谱峰，在227、280 nm有较大吸收，符合辣椒生物碱的UV光谱特征，确定为辣椒生物碱，故选择以正己烷为提取溶剂。图1 正己烷提取物的HPLC图及UV光谱图Fig.1 HPLC chromatogram and UV spectrum of extract obtained by n–hexane2.2 辣椒生物碱的高速逆流色谱(HSCCC)分离结果2.2.1 HSCCC两相溶剂体系的确定多个不同配比的溶剂体系的K值测定结果(表1)表明，体系5即正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水、冰乙酸体积比为15∶15∶20∶20∶7.5时，化合物1、化合物2的K值较小，分离度值最大，可作为后续分离体系。表 1 不同溶剂体系的K值及分离度Table 1 K–values and resolutions of the compounds in different two–phase solvent systemsK值体系 正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水∶冰乙酸(V/V) 组分I 组分II 分离度1 15∶15∶20∶20∶4 3.68 5.34 1.45 2 15∶15∶20∶20∶3.5 3.70 5.70 1.54 3 10∶15∶20∶20∶4 3.69 5.94 1.61 4 15∶15∶20∶20∶6 2.10 2.90 1.38 5 15∶15∶20∶20∶7.5 1.80 2.99 1.66图2 HSCCC分离色谱图Fig.2 HSCCC chromatogram of the purification of capsaicinoids from capsicum图3 化合物1的 HPLC 检测图谱及UV图Fig.3 HPLC chromatogram and UV spectrum of compound 12.3 HSCCC分离条件优化及分离效果2次进样收集的流出液Ⅰ、Ⅱ，HSCCC分离色谱图见图2。经HPLC检测分别为化合物1、化合物2，见图3、图4。得到纯度为98.2%的化合物1干粉22 mg，纯度为98.0%的化合物2干粉16 mg。图4 化合物2的HPLC图和UV光谱图Fig.4 HPLC chromatogram and UV spectrum of compound 22.4 化合物结构的鉴定结果得到的化合物1、化合物2均为白色粉末， 正离子模式ESI–MS，m/z分别为308.226 7[M+H]+、306.216 2[M+H]+，其核磁共振H谱与C谱信息如表2所示。结合文献[15]，确定化合物1、化合物2分别为二氢辣椒素和辣椒素，其结构式如图5所示。表2 二氢辣椒素和辣椒素核磁共振H谱与C谱信息Table 21H and13C NMR spectroscopic datas for capsaicin and dihydrocapsaicin.化合物1 化合物213C NMR DEPT1H NMR13C NMR DEPT1H NMR 1 130.577 C — 131.545 C 4.33 (d, 5.4)2 110.840 CH 6.76(s) 112.489 CH 6.79(d,1.8)3 146.842 C — 148.992 C —4 145.281 C — 146.814 C —5 114.507 CH 6.84(d,8.4) 116.088 CH 6.84(d,8.4)6 120.967 CH 6.74(d,8.4) 121.411 CH 6.74(dd,1.8,8.4)7 43.685 CH24.33(d,5.4) 43.956 CH24.33 (d, 5.4)8 — — 5.93(br s) — — 5.90 (br s)9 173.020 C — 175.945 C —10 37.037 CH22.19(t,7.8) 36.979 CH22.20 (t, 7.8)11 25.944 CH21.64(q,7.2) 26.585 CH21.64 (q, 7.8)12 29.509 CH21.31(m) 30.291 CH21.38 (q, 7.8)13 29.767 CH21.29(m) 32.269 CH21.98 (q, 7.2)14 27.382 CH21.26(m) 127.863 CH 5.35 (m)15 39.099 CH21.13(m) 139.100 CH 5.30 (m)16 28.088 CH 1.50(m) 33.250 CH 1.29 (s)17 22.767 CH30.84(d,6.0) 23.108 CH30.95 (d, 6.6)18 22.767 CH30.85(d,6.0) 23.108 CH30.94 (d, 6.6)OCH356.091 CH33.85(s) 56.355 CH33.85 (s)OH — — 5.89(br s) — — 5.86 (br s)图5 化合物1、化合物2的化学结构式Fig. 5 Structures of compound 1 and 22.5 2个化合物的抗炎活性1) 化合物对细胞活力的影响。经二氢辣椒素、辣椒素处理后的巨噬细胞 RAW264.7活力与空白组、模型组无明显差异，且随着二氢辣椒素、辣椒素浓度的增高，巨噬细胞RAW264.7的活力基本不变。由表3可知，在 3.1 ~ 100 μmol/L范围内，二氢辣椒素和辣椒素对巨噬细胞RAW264.7活力没有影响，对巨噬细胞RAW264.7没有毒性。表3 不同浓度的二氢辣椒素和辣椒素对RAW264.7细胞活力的影响Table 3 Effect of different concentrations of capsaicin and dihydrocapsaicin on RAW264.7 cell viabilityRAW264.7存活率%各浓度组别 化合物1 化合物2 100.0 μmol/L 99.8 99.4 50.0 μmol/L 96.2 97.6 25.0 μmol/L 102.7 99.4 12.5 μmol/L 100.8 100.5 6.3 μmol/L 97.7 101.9 3.1 μmol/L 100.7 101.9空白组 100.0 100.0模型组 100.6 103.62) 化合物对炎症细胞NO释放量的影响。二氢辣椒素、辣椒素和阳性对照吲哚美辛对巨噬细胞RAW264.7释放 NO 的 IC50分别为(42.66±4.88)、(25.68±3.86)、(127.88 ± 2.45) μmol/L；因此，辣椒素和二氢辣椒素的抗炎作用均明显强于吲哚美辛，且辣椒素的抗炎效果好于二氢辣椒素。3 结论通过正己烷回流提取干辣椒粉的生物碱，采用正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水、冰乙酸的体积比15∶15∶20∶20∶7.5为溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，流速2 mL/min，主机转速850 r/min，分离温度25 ℃，检测波长为270 nm，600 mg样品采用高速逆流色谱分2次连续进样，获得22 mg、纯度为98.2%二氢辣椒素和16 mg、纯度为98.0%的辣椒素。二氢辣椒素、辣椒素对巨噬细胞RAW264.7释放 NO 的 IC50分别为(42.66±4.88)、(25.68±3.86) μmol/L，明显低于阳性对照吲哚美辛；因此，辣椒素和二氢辣椒素对巨噬细胞 RAW264.7的抗炎作用均明显强于吲哚美辛，且辣椒素的抗炎效果好于二氢辣椒素。参考文献：[1] 张玲，吴凤娜．辣椒的营养保健功能及功能成分研究进展[J]．山东食品发酵，2011(4)：39–42．[2] 詹家荣．辣椒素的制备技术以及应用前景[J]．化学试剂，2010，32(5)：28–30．[3] 康雅．辣椒提取物的分离纯化及生物活性研究[D]．重庆：西南大学，2011．[4] 吴艳阳，陈开勋，邵纪生．辣椒素的制备工艺及分析方法[J]．化学世界，2004，45(4)：218–221．[5] O'SULLIVAN S E，KENDALL D A，RANDALL M D.Heterogeneity in the mechanisms of vasorelaxation to anandamide in resistance and conduit rat mesenteric arteries[J]．British Journal of Pharmacology，2004，142(3)：435–442．[6] 党元野，陈修平，张庆文，等．辣椒碱的药理作用研究进展[J]．中药药理与临床，2009(4)：84–89．[7] 郭丽，王巧珍，朱林．辣椒碱抗病原菌活性及其在番茄酱防腐中的应用[J]．合肥工业大学学报(自然科学版)，2006，29(1)：117–121．[8] HURTADO–LóPEZ P，MURDAN S．Formulation and characterisation of zein microspheres as delivery vehicles[J].Journal of Drug Delivery Science & Technology，2005，15(4)：267–272．[9] TANDA R，LEWIS G A，BADGER G B，et al．Topical capsaicin in painful diabetic neuropathy．Effect on sensory function[J]. Survey of Anesthesiology，1992，36(5)：311．[10] 艾秀珍．辣椒碱类化合物及辣椒碱单体的提取与纯化[D]．杭州：浙江大学，2007．[11] 张正海，毛胜利，王立浩，等．辣椒的辣味遗传控制与辣椒素生物合成研究进展[J]．园艺学报，2014，41(9)：1821–1832．[12] 吴丽威，孙颖，孙秀敏，等．无溶剂微波预处理NaOH溶液搅拌法提取干红辣椒中的辣椒素[J]．分析化学，2010，38(11)：1661–1664．[13] 孙平，唐小华，卜庆珍，等．辣椒素提取工艺的比较[J]．食品科学，2008，29(8)：238–240．[14] 熊科，夏延斌．辣椒素提取方法研究进展[J]．中国食品添加剂，2007，7(3)：88–91．[15] LI F，LIN Y，WANG X，et al．Preparative isolation and purification of capsaicinoids from capsicum frutescens using high–speed counter–current chromatography[J]. Separation& Purification Technology，2009，64(3)：304–308．

文章来源：辣椒 网址: http://lj.400nongye.com/lunwen/itemid-30579.shtml

上一篇： 辣椒与诺贝尔奖
下一篇： 园艺论文_辣椒新品种濮椒6号优质高效制种技术